摘要
选取45只雄性SD大鼠，分为假手术组（5只）、脑缺血再灌注组（20只）、褪黑素干预组（20只）；脑缺血再灌注组和褪黑素干预组根据时间点第6小时、第1天、第3天、第7天分为4个组，每组5只。采用Longa线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，采用HE染色检测脑组织的病理改变，TUNEL染色检测神经细胞的凋亡，免疫组织化学（免疫组化）法及蛋白质印迹法(Western Blotting)观察大鼠脑组织内c-fos表达情况。
在脑缺血再灌注组的各时间点的HE染色显示，胶质细胞呈现程度不一的增生，神经元出现坏死；褪黑素干预能减轻脑缺血再灌注后胶质细胞增生及神经元的坏死。在TUNEL染色凋亡检测中，脑缺血再灌注组各时间点的神经细胞凋亡升高；褪黑素干预组各时间点的细胞凋亡数低于脑缺血再灌注组(P <0.05)。在免疫组化及蛋白质印迹检测中，脑缺血再灌注组c-fos表达增加，在第1天时达到高峰，之后表达逐步降低；在褪黑素干预组，c-fos表达趋势与缺血再灌注组一致，但表达水平比缺血再灌注组相应时间点低，差异有统计学意义(P <0.05)。
褪黑素（Melatonin）是一种由松果体分泌的吲哚类激素，被认为是一种具有显著作用的抗氧化剂，能够全面激活抗氧化酶、减少自由基水平，积极减缓自由基针对于组织的破坏效
c-fos基因被认为是中枢神经系统最具有典型意义的即刻早期化基因（immediate early gene， IEG）类
择取购买自湖北省实验动物研究中心的45只雄性SD大鼠为研究的动物模型载体。体质量（250±20）g。
将SD大鼠分为假手术组（5只）、脑缺血再灌注组（20只）、褪黑素干预组（20只）。
假手术组仅分离单侧颈总及颈内和外动脉，不予夹闭，处死；缺血再灌注组制模成功后按I/R后第6小时、第1天、第3天、第7天分为4组，每组5只大鼠；褪黑素干预组在制模前3天开始，给予褪黑素10 mg/（kg·d）灌胃，直到处死，按与缺血再灌注组相应时间点将其分为4组，每组5只大鼠。
应用浓度为10%水合氯醛为麻醉剂，在大鼠腹腔注射浓度为3.5 mg/kg的药物实施麻醉。以仰卧状态平放，并做好颈部消毒工作。剪开小鼠颈部正中部位，对右侧的颈部总动脉、颈内动脉及颈外动脉分离处理。右颈总动脉以及颈外动脉应用尼龙线结扎处理。颈内动脉应用动脉夹进行夹闭处理。于实验大鼠的右颈总动脉分叉膨大处开放一个“V”样口。在此之后把阻塞线自切口插进，缓慢送入颈内动脉，感到有轻微阻力即停止，随后碘伏消毒，需要说明的是，应当在皮肤缝合位置外留置大概规格为1 cm的丝线。在缺血处理之后120 min，对实验动物再次进行麻醉处理。完成上述工作之后，退出阻塞线，以导致缺血后再灌注。假手术组仅分离右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉，缝合伤口，不插入线栓。
依照先后顺序，将经过以上步骤处理的切片放到阶梯浓度酒精之内，为了避免液体流失，在甩干处理之后于组织四周应用组化笔画圆圈。并在画好的圆圈之内滴加蛋白酶K工作液，全面盖住组织。孵育15 min后洗涤。在适当干燥处理之后在加入破膜工作液盖住组织。孵育10 min后再次洗涤。在TUNEL试剂盒之中，调试混合试剂覆盖组织。把制作好的切片放到湿盒之中，使用37℃水浴锅孵育处理，共计1 h。加入适量DAPI染液，使用抗荧光淬灭封片剂封片处理。应用荧光显微镜观察，拍照。
对实验大鼠脑组织实施石蜡包埋切片及烘干处理。切片放置于浓度为3%过氧化氢溶液内，目的在于灭活处理内源过氧化物酶。次日应用PBS洗涤处理，共计进行3次。在此之后，滴入二抗，完成PBS洗涤和DAB染色。显色以后应用苏木精完成复染工作。脱水、透明、封固。镜下观察并拍照。
脑组织在PBS缓冲液漂洗后加入相当于10倍的蛋白提取剂，冰浴处理匀浆。完成离心对上清液加以收集，得出总蛋白溶液。样本蛋白浓度测定应用BCA蛋白质浓度测定试剂盒完成。在此之后实施电泳、转膜、抗体孵育。通过ECL反应完成化学发光检测。结合实际光照情况有效调节曝光参数。显影，定影。完成以上步骤之后，实施扫描以及存档，应用AlphaEaseFC软件，对目标带光密度值情况进行全面分析。
假手术组大鼠脑组织结构没有明显变化。在缺血再灌注组中，胶质细胞出现增生，神经元发生坏死，并且随着缺血再灌注时间的延长而逐渐加重。褪黑素干预后，胶质细胞增生及神经元坏死与缺血再灌注组相同时间点比较，明显减轻。因脑缺血再灌注组及褪黑素干预组在实验中的胶质细胞增生、神经元坏死、细胞凋亡数、c-fos表达、蛋白印迹灰度比均在再灌注后第1天时达到峰值，故均选取峰值时的镜下图片可示明显对比。见
图1 各组脑组织病理学变化（HE染色，×400），光镜下可见褪黑素干预组中的胶质细胞增生及神经元坏死要重于假手术组，且轻于缺血再灌注组
A：假手术组；B：缺血再灌注后第1天；C：褪黑素干预后第1天
假手术组的平均凋亡率低。脑缺血再灌注组和褪黑素干预组中细胞凋亡数在各个时间点均高于假手术组，于再灌注后第1天时达高峰，随后逐渐减少。褪黑素干预组的各时间点的细胞凋亡数与缺血再灌注组变化趋势一致，但低于脑缺血再灌注组（P<0.05）。见
图2 细胞凋亡对比（荧光显微镜，×400）
A：缺血再灌注后第1天；B：褪黑素干预后第1天
注： 因假手术的老鼠样本未行缺血再灌注处理，直接处死，故于各个时间点的细胞凋亡数均同一数据。①与假手术组比较，P<0.05；②与脑缺血再灌注组比较，P<0.05
脑缺血再灌注组与褪黑素干预组在不同时间点的Tunel凋亡指数比较，采用重复测量的方差分析，结果：①不同时间点间的tunel凋亡指数有差别（第6小时F=8.38，P=0.00；第1天F=77.66，P=0.00；第3天F=70.597，P=0.00；第7天F=95.895，P=0.00）；②褪黑素干预组与脑缺血再灌注组的tunel凋亡指数变化趋势有差别（脑缺血再灌注组F=88.168，P=0.00；褪黑素干预组F=60.649，P=0.00）。见
在假手术组的脑部组织内神经细胞之内的c-fos表达呈微弱阳性，偶有阳性细胞。脑缺血再灌注组的c-fos表达增加，从I/R后第6小时开始c-fos的表达量增加，第1天时达高峰，第3天起c-fos表达逐渐减少。褪黑素干预组与缺血再灌注组的c-fos表达趋势大致相同，但c-fos在各时间节点的表达率前者低于脑缺血再灌注组。见
图3 各组免疫组化中c-fos表达的差异（光镜下，×400）
A：假手术组；B：缺血再灌注后第1天；C：褪黑素干预后第1天
注： 因假手术的老鼠样本未行缺血再灌注处理，直接处死，故于各个时间点的细胞凋亡数均同一数据。①与假手术组比较，P<0.05；②与脑缺血再灌注组比较，P<0.05
IEG又被称原癌基因（proto-oncogene），也被视为发生大脑缺血之后迅速表达的基因组类型。其中c-fos基因组为最为典型且重要的基因种
本实验发现，大鼠脑缺血再灌注后，c-fos表达增加。既往的研究表明，其可能的机制是：①脑缺氧缺血再灌注时必需氨基酸（essential amino acid， EAA）释放增多，N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体被激活，可诱导c-fos表
由此发现，c-fos的具体表达情况能被视为一种反映脑缺血再灌注时细胞代谢改变的新型指标，其有可能成为评定针对于脑缺血再灌注相关药品治疗成效的新方
褪黑素具有全面清除机体中自由基、抗炎、减少癌细胞增殖以及抗氧化的生物学效应，能对人体生殖系统、内分泌系统以及神经系统起保护作
目前，在脑缺血再灌注损伤中探究褪黑素与c-fos的关系研究甚少。本实验需要阐明在脑缺血再灌注损伤中褪黑素的神经保护作用是否与调控c-fos的表达水平相关。我们在大鼠脑缺血再灌注模型中通过加入外源性褪黑素，检测其是否能够影响体内c-fos的表达，从而产生神经保护作用。本研究发现，大鼠脑缺血再灌注后c-fos表达增加，褪黑素处理后能减少神经细胞死亡，减少c-fos的表达。
因此，褪黑素可能通过调节c-fos的表达，在大脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。本研究将为褪黑素对于脑缺血性疾病的临床诊疗提供实验基础。
参 考 文 献
Kim MY, Zhang T, Kraus WL. Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1: 'PAR-laying' NA
Lonskaya I, Potaman VN, Shlyakhtenko LS, et al. Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 by DNA structure-specific binding[J]. J Biol Chem, 2005, 280(17): 17076-17083. [百度学术]
程倚萌，娄季宇，王金兰，等．大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马Bcl-2、Bax蛋白的表达[J]．中国实用神经疾病杂志, 2007, 10(3): 95-97. [百度学术]
Benchoua A, Guégan C, Couriaud C, et al. Specific caspase pathways are activated in the two stages of cerebral infarction[J]. J Neurosci, 2001, 21(18): 7127-7134. [百度学术]
Jun Z, Li Z, Fang W, et al. Melatonin decreases levels of S100β and NFκB, increases levels of synaptophysin in a rat model of Alzheimer's disease[J]. Curr Aging Sci, 2013, 6(2): 142-149. [百度学术]
Funahashi M, He YF, Sugimoto T, et al. Noxious tooth pulp stimulation suppresses c-fos expression in the rat hippocampal formation[J]. Brain Res, 1999, 827(1-2): 215-220. [百度学术]
周珂，李庚山，余绍祖．脑缺血再灌注损伤时 c-fos、c-jun 的表达和细胞凋亡[J]．卒中与神经疾病, 2003, 10(1): 3-6. [百度学术]
张婷卓，杜小正，王金海，等．c-fos基因表达在脑缺血中的研究进展[J]．甘肃中医药大学学报, 2017, 34(5): 78-81. [百度学术]
Joo JY, Schaukowitch K, Farbiak L, et al. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers[J]. Nat Neurosci, 2016, 19(1): 75-83. [百度学术]
张学君，林雨芳，吴强，等．干预次序对局灶性脑缺血大鼠c-fos表达的影响[J]．福建中医药大学学报, 2012, 22(5): 25-27. [百度学术]
Whitfield J, Neame SJ, Paquet L, et al. Dominant-negative c-Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrome c release[J]. Neuron, 2001, 29(3): 629-643. [百度学术]
Silveira DC, Sogawa Y, Holmes GL. The expression of fos following kainic acid-induced seizures is age-dependent[J]. Eur J Neurosci, 2002, 15(2): 329-344. [百度学术]
Takei N, Tanaka O, Endo Y, et al. BDNF and NT-3 but not CNTF counteract the C
Malinski T, Bailey F, Zhang ZG, et al. Nitric oxide measured by a porphyrinic microsensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1993, 13(3): 355-358. [百度学术]
刘沁华，夏瑞祥，李嘉嘉．褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞作用的研究[J]．安徽医学, 2010, 31(7): 726-729. [百度学术]
卫杏利，胡治平．阿托伐他汀对沙鼠脑缺血再灌注损伤后c-fos表达的影响[J]．长治医学院学报, 2017, 31(1): 20-23. [百度学术]
Radogna F, Sestili P, Martinelli C, et al. Lipoxygenase-mediated pro-radical effect of melatonin via stimulation of arachidonic acid metabolism[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2009, 238(2): 170-177. [百度学术]
