血清神经来源外泌体miR-221、miR-214与帕金森病认知障碍的相关性

于慧娟，刘锡荣，古力加乃提·麦麦吐逊; YU Hui-Juan; LIU Xi-Rong; Gulijianaiti?Maimaituxun

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血清神经来源外泌体miR-221、miR-214与帕金森病认知障碍的相关性 PDF

- ORCID：
于慧娟
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刘锡荣
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古力加乃提·麦麦吐逊

喀什地区第一人民医院神经内二科，新疆喀什 844000

中图分类号： 742.5

最近更新：2021-07-08

DOI：10.16636/j.cnki.jinn.1673-2642.2021.02.002

摘要

目的

探讨血清神经来源外泌体miR-221、miR-214与帕金森病(PD)认知障碍的相关性。

方法

纳入150例PD患者（PD组）、100例健康体检者（对照组），PD组根据认知障碍程度分为正常组（PD-N组）、轻度障碍组（PD-MCI组）、痴呆组（PD-D组）。采用实时荧光定量PCR检测外泌体miR-221、miR-214表达水平；分析两者表达与帕金森综合评分(UPDRS)、蒙特利尔认知评估(MoCA)的相关性；绘制ROC曲线分析两者表达对PD认知障碍的预测价值。

结果

PD组血清神经来源外泌体miR-221、miR-214表达水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。PD-N组外泌体miR-221、miR-214表达水平较PD-MCI、PD-D组高，差异有统计学意义(P<0.05)。PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平均与UPDRS评分呈负相关、与MoCA评分呈正相关(P<0.05)。外泌体miR-221、miR-214表达水平及两者联合预测PD认知障碍的ROC曲线下面积分别为0.700、0.714、0.794(P<0.05)。

结论

PD患者血清神经来源外泌体miR-221、miR-214表达水平下调；与PD病情及认知障碍严重程度相关；两者联合检测对PD认知障碍具有一定预测价值。

关键词

帕金森病; 认知障碍; 外泌体miR-221; 外泌体miR-214; 相关性

帕金森病（Parkinson’s disease， PD）是以肌肉僵直、静止震颤、步态改变为主要表现的常见神经变性病，随着病情进展可引起自主神经功能、睡眠、感觉、认知等多方面障碍^［

1］。其中认知障碍在PD中十分常见，其发生不仅增加患者痛苦、影响生存质量，也给家庭乃至社会带来沉重压力，但当前临床缺乏对PD认知障碍的早期识别，使得患者治疗延误^{［参考文献 2

百度学术}2］。外泌体作为一种重要的细胞间信号转导载体，具有蛋白、脂质、DNA、miRNA等多种检测靶点，其携带的miRNA可参与细胞增殖、分化、凋亡等多个病理、生理过程，因其具有分泌选择性、高稳定性及易检测性特征，被认为在神经变性病、心血管疾病等多种疾病诊断中具有潜在应用价值^{［参考文献 3-4}3-4］。本研究重点分析血清神经来源外泌体miR-221、miR-214在PD患者中表达及与患者认知障碍相关性，为临床PD认知障碍早期识别及干预提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

通过简单随机抽样法纳入2017年1月—2019年12月喀什地区第一人民医院门诊或住院的PD患者150例（PD组）。根据认知障碍程度^［

6-7］，分为正常组（PD-N组）、轻度障碍组（PD-MCI组）、痴呆组（PD-D组）。另选择同期100例健康体检者为对照组。

纳入标准：①符合中国帕金森病诊断标准（2016版）^［

5］中PD诊断；②年龄55~85岁；③小学及以上受教育水平；④患者及家属签署知情同意。

排除标准：①合并其他中枢神经系统疾病；②存在严重心血管疾病、恶性肿瘤、重要脏器功能不全、血液系统疾病；③伴听力、视力或表达障碍；④既往神经病史；⑤酒精、药物滥用史；⑥无法获得配合。

本研究经喀什地区第一人民医院医学伦理委员会批准（批准文号：20170126）。

1.2 研究方法

1.2.1 血清神经来源外泌体提取

采取免疫沉淀法，主要步骤如下：①采集外周静脉血5 ml，室温静置10 min，于4℃下离心（2500 r/min）15 min，提取上清液0.5 mL分装到1.5 mlL EP管，于-80℃保存。②取出样本快速解冻后，加入0.15 mL促凝血酶原激酶-D于室温下溶解，室温下静置60 min。③加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂混合物的无钙、无镁DBS^-2液0.35 mL。④4℃下离心（3000 r/min）20 min，弃沉淀物。⑤取上清液加入ExoQuick试剂0.25 mL，4℃下培育1 h。⑥4℃下离心（1500 r/min）30 min后，保留沉淀（即外泌体），沉淀加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂DBS^-2液0.35 mL。⑦加入L1细胞黏附分子（L1CAM）生物素化抗体2 µL，再加3%的牛血清蛋白（BSA）50 µL，于4℃条件下静置1 h后，加入链霉素和素琼脂糖25 µL，再加3%的BSA 50 µL，4℃条件下静置30 min。⑧4℃下离心（400 r/min）10 min，去上清液、留沉淀，沉淀加0.05 mmol/L的甘氨酸-盐酸（pH 3.0）50 µl，涡流10 s。⑨新悬浮的外泌体微粒于-80℃保存。

1.2.2 外泌体鉴定

采用透射电子显微镜观察外泌体形态，蛋白免疫印迹法（Western blotting）鉴定表面标志物。

1.2.3 外泌体miRNA提取

采用mirVana RNA Isolation Kit试剂（上海艾博思生物科技有限公司）从外泌体样本中提取RNA，严格按试剂盒操作，检测并分离miR-221、miR-214。

1.2.4 miRNA逆转录

建立15 µL逆转录体系（日本TAKARA公司）获得逆转录产物cDNA，包括1.5 µL 10×RT缓冲液、0.15 µL 100 mmol/L dNTP、1 µL 50 u/µL逆转录酶、4.16 µL焦炭酸二乙酯水、5 µL miRNA、3 µL 10 µmol/L miRNA-21反转录茎环引物（上海英骏公司）。RT体系冰上孵育5 min后，放入Gene Amp PCR System 9700（美国ABI公司），反应条件16℃、42℃、85℃分别30 min、30 min、5 min，逆转录产物于-20℃下保存。

1.2.5 PCR扩增与检测

采用TaqMan Pri-miRNA Assays（美国Invitrogen公司）建立20 µL反应体系，包括12.15 µL DEPC水、4 µL缓冲液、10 µmol/L miRNA-21正向、反向引物（上海英骏公司）各0.6 µL、0.4 µL 10 µmol/L TaqMan MGB探针、2 µL逆转录产物、0.25 µL 50×ROX。采用实时荧光定量PCR仪（美国ABI QuantStudio5型），扩增条件：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环；采用2^-△△ct法定量分析miRNA-221、miR-214表达水平。

1.2.6 量表评估

帕金森综合评分量表（Unified Parkinson’s Disease Rating Scale， UPDRS）^［

8］内容包括精神、行为和情绪，日常生活能力，运动检查3个部分，共31项内容，均采用0~4分5级评分，总得分越高，病情越严重。蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment， MoCA）^{［参考文献 9

百度学术}9］包括8个认知领域共11项内容，总分30分，得分越低，意味着认知功能越差。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理和分析。正态分布计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较行独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采取LSD-t法。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ²检验。相关性分析采用Pearson相关分析法；绘制ROC曲线分析外泌体miRNA-221、miR-214表达水平对PD认知障碍预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD组与对照组一般资料比较

PD组与对照组性别、年龄、体重指数、文化程度、合并基础疾病比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 PD组与对照组一般资料比较

项目	PD组 (n=150)	对照组 (n=100)	χ²/t值	P值
性别（男/女）/例	85/65	57/43	0.003	0.958
年龄/岁	73.84±6.96	74.29±5.38	0.401	0.527
体重指数/(kg/m²)	23.14±2.92	22.89±2.59	0.964	0.338
文化程度例（%）
初中及以下	71(47.33)	46(46.00)	0.654	0.721
中学及中专	52(34.67)	39(39.00)	－	－
大专及以上	27(18.00)	15(15.00)	－	－
基础疾病例（%）
合并糖尿病	29(19.33)	16(16.00)	0.452	0.502
合并高血压	35(23.33)	21(21.00)	0.188	0.665
UPDRS评分/分	36.42±4.46	－	－	－
MoCA评分/分	24.37±5.09	－	－	－

2.2 PD组与对照组外泌体miR-221、miR-214表达水平比较

PD组血清神经来源外泌体miR-221、miR-214表达水平均低于对照组（P<0.05）。见表2。

表2 PD组与对照组外泌体miR-221、miR-214表达水平比较

组别	例数	miR-221	miR-214
PD组	150	21.15±7.48	23.23±7.26
对照组	100	35.95±5.62	32.36±5.34
t值		15.337	10.827
P值		<0.001	<0.001

2.3 不同认知障碍程度PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平比较

不同认知障碍程度PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），表现为PD-N组>PD-MCI组>PD-D组（P<0.05）。见表3。

表3 不同认知障碍程度PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平比较

组别	例数	miR-221	miR-214
PD-N组	77	24.26±8.09	25.88±6.84
PD-MCI组	43	20.20±7.34^①	22.74±6.42^①
PD-D组	30	14.49±4.52^①②	17.13±4.35^①②
F值		20.223	21.406
P值		<0.001	<0.001

注： ①与PD-N组比较，P<0.05；②与PD-MCI组比较，P<0.05

2.4 PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平与临床评分相关性

Pearson相关性分析显示，PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平均与UPDRS评分呈负相关、与MoCA评分呈正相关（P<0.05）。见表4。

表4 PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平与UPDRS、MoCA评分相关性

项目	UPDRS评分		MoCA评分
项目	r值	P值	r值	P值
miR-221	-0.514	0.007	0.628	<0.001
miR-214	-0.492	0.009	0.571	<0.001

2.5 外泌体miR-221、miR-214表达水平对PD认知障碍的预测价值

以外泌体miR-221、miR-214表达水平为检验变量，以是否合并认知障碍为状态变量，绘制ROC曲线，结果显示，外泌体miR-221、miR-214表达水平及两者联合预测PD患者合并认知障碍的ROC曲线下面积分别为0.700、0.714、0.794（P<0.05），其中miR-221最佳截断值为18.62，对应敏感度、特异度分别为0.558、0.795；miR-214最佳截断值为23.60，对应敏感度、特异度分别为0.701、0.644。见图1、表5。

图1 外泌体miR-221、miR-214水平预测PD认知障碍的ROC曲线

表5 外泌体miR-221、miR-214水平预测PD认知障碍的ROC曲线下面积

指标	AUC	标准误	P值	95%CI		Cut-off值	敏感度	特异度
指标	AUC	标准误	P值	下限	上限	Cut-off值	敏感度	特异度
miR-221	0.700	0.043	<0.001	0.616	0.784	18.62	0.558	0.795
miR-214	0.714	0.042	<0.001	0.632	0.797	23.60	0.701	0.644
两者联合	0.794	0.037	<0.001	0.721	0.867	－	－	－

3 讨论

有数据显示，30%~60%的PD患者可合并有不同程度的认知功能障碍，其中30%以上PD患者最终可发展成帕金森痴呆^［

10］。当前，PD认知障碍病因学机制并未完全阐明，一般认为和PD特征性神经病理学变化及多巴胺、5-羟色胺、乙酰胆碱等神经递质失衡有关^{［参考文献 11

百度学术}11］。目前并无确切有效措施逆转PD认知功能障碍进展，早期干预是关键，但PD患者早期认知障碍表现并不明显，且临床缺乏早期识别意识，寻找有效的早期指征以指导干预是研究重点。

神经组织表达的miRNA种类丰富、组织特异性明显，当miRNA表达失衡时，可导致相应特异性蛋白表达失衡，进而参与神经系统疾病^［

12］。外泌体因体积小可从中枢神经系统透过血脑屏障进入血液循环，其可携带致病状态下表达的失调或疾病特异性miRNA，而这类miRNA在外泌体保护下能免受细胞核糖核酸酶降解，故神经来源外泌体miRNA在神经系统疾病诊疗中良好应用前景^{［参考文献 13

百度学术}13］。miRNA-221位于人染色体Xpl1.3区带，其表达与神经胶质瘤、多种恶性肿瘤及炎症性疾病有关，目前在PD中表达也受到重视^{［参考文献 14

百度学术}14］。miRNA-214位于人1号染色体q24，3的DNM3基因中，其首次在宫颈癌HeLa细胞凋亡中发现，后来被证实可参与神经系统、骨骼、肌肉等细胞增长、分化及形态变化等过程，发挥多项生理功能^{［参考文献 15

百度学术}15］。

本研究发现，PD患者血清神经来源外泌体miR-221、miR-214表达明显较健康人群下调，提示miR-221、miR-214表达可能参与PD发生。有研究指出^［

16］，α-突触核蛋白（α-synuclein， SNCA）作为路易小体主要成分，其异常聚集可引起氧化损伤、多巴胺神经元大量凋亡等病理变化，是PD病理核心所在，而miR-221、miR-214、miRNA-153、miRNA-141等多种miRNA可参与SNCA调控，这类miRNA表达下调可能是SNCA过量表达的重要原因。本研究进一步分析发现，miR-221、miR-214在合并PD-MCI或PD-D患者中表达水平较无认知障碍者更低，提示miR-221、miR-214下调可能参与PD认知障碍进程。有研究指出^{［参考文献 17

百度学术}17］，PD患者多存在皮质小脑微血管受损、脑白质结构改变，且认知功能损害严重者，这些变化更加明显。还有研究发现^{［参考文献 18

百度学术}18］，内皮细胞自噬失衡是引起血管微血管病变的重要过程，其调节受多个信号通路影响，而miR-221可通过调控PTEN/Akt信号通路来调节内皮细胞自噬，当神经组织miR-221表达下调后，PTEN表达可升高，抑制Akt磷酸化，造成自噬作用增强，进而介导脑微血管损伤，而脑微血管受损与腔隙性脑梗死、神经胶质增生、脑白质病变等关联密切，最后可通过破坏长联络纤维、额叶-皮质下联络通路导致认知功能障碍发生。上述研究或许可解释PD认知功能障碍越严重者miR-221表达越低。研究表明^{［参考文献 19

百度学术}19］，海马神经元凋亡、兴奋性突触传递异常与认知障碍发生关联密切。而miR-214有抑制海马神经元自噬及凋亡、控制神经突向外生长、调控神经元分化等作用，其表达下调后，这些作用随之减弱^{［参考文献 20

百度学术}20］。或可解释本文认知功能障碍严重者miR-221表达更低这一结果。冷利发^{［参考文献 21

百度学术}21］的研究指出，过量的组织蛋白酶B（cathepsin B， CTSB）参与了神经系统炎症反应、SNCA寡聚物生成、多巴胺能神经元活力抑制等过程，在PD发生发展中占重要地位，而miR-214经酶切后形成的重要转录物miR-214-3p可通过与CTSB基因结合，下调CTSB蛋白表达，进而削弱其作用。当miR-214表达下调后，其重要转录物miR-214-3p也下调，对CTSB蛋白抑制作用减弱，可能也与PD认知障碍进程有关。

本研究还发现，PD患者外泌体miR-221、miR-214表达水平均与UPDRS评分呈负相关、与MoCA评分呈正相关，进一步提示miR-221、miR-214表达与PD病情严重程度、认知障碍程度有相关性。此外，外泌体miR-221、miR-214水平及两者联合预测PD患者合并认知障碍的ROC曲线下面积分别为0.700、0.714、0.794，提示联合miR-221、miR-214检测对PD患者认知障碍有一定预测价值，这一研究结果或可为PD患者外泌体miRNA靶向治疗及PD早期认知障碍识别带来契机。

综上所述，血清神经来源外泌体miR-221、miR-214在PD患者表达水平下调，且随着认知障碍越严重，其表达水平越低，联合两者检测对PD认知障碍识别有一定预测价值，值得深入研究。

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