摘要
2019年1月至2022年7月从齐齐哈尔市第一医院神经内科招募了两组参与者作为样本。在第一组样本中包括58名轻度至重度AD患者和20名健康老年对照组；另一组样本包括37名轻度至中度AD患者的样本，其中18名患者接受了24周的多奈哌齐治疗，19名患者接受了24周安慰剂治疗。从患者的血液标本中提取神经元衍生的细胞外囊泡（EV），采用酶联免疫吸附分析试剂盒对β淀粉样蛋白42（Aβ42）、P⁃T181⁃tau、P⁃S396⁃tau、总tau蛋白（t⁃tau）、神经颗粒蛋白（NRGN）水平进行分析。
与对照组相比，AD患者的EV中Aβ42、t⁃tau、P⁃T181⁃tau、P⁃S396⁃tau水平显著升高（P<0.05），NRGN水平显著降低（P<0.05）。在AD患者中，t⁃tau、NRGN和沉默转录因子（REST）的EV水平与简易智力状态检查量表（MMSE）和阿尔茨海默病合作研究–日常生活活动量表（ADCS⁃ADL）评分呈负相关（P< 0.05），并与阿尔茨海默病评估量表–认知子量表的14项扩展版本（ADAS⁃cog+）评分呈正相关（P<0.05）。在为期24周的治疗期间，与安慰剂组患者相比，多奈哌齐组患者血浆中Aβ42、t⁃tau、P⁃T181⁃tau和P⁃S396⁃tau的表达水平（EV水平）从基线水平到第24周结束时均呈显著降低趋势（P<0.05）。
电子、语音版
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是最常见的痴呆症，主要是由预期寿命的平行增加引起的，迫切需要开发合适和有效的治疗药
神经元衍生的细胞外囊泡（extracellular vesicles， EV）是由中枢神经系统神经元释放的核内体来源的细胞EV，能够穿过血脑屏
2019年1月至2022年7月从齐齐哈尔市第一医院神经内科招募了两组参与者作为样本。
纳入标准：①符合AD诊
排除标准：①患有任何其他重大神经或精神疾病、活动性过敏、不稳定医疗状况或具有临床意义的实验室异常的受试者；②在医学评估中表现出有临床意义的抑郁症和（或）汉密尔顿抑郁量表17项子量表得分高于15分的患者。
在第一组样本中，纳入了58名轻度至重度AD患者（19名轻度、21名中度和18名重度AD病例）和20名健康老年对照组（15名女性）。
在第二组样本中，纳入了37名轻度至中度AD患者的样本，其中18名（轻度9例和中度9例）患者接受了24周多奈哌齐治疗（第1～4周：每日1次，每次5 mg；在第5～24周：每日1次，每次10 mg），另外19名（轻度9例和中度10例）患者则接受了24周安慰剂治疗。
在开始研究前，所有参与者签署了书面知情同意书。
在AD和对照病例的基线，以及在多奈哌齐治疗AD患者的基线和第24周（研究终点）时获得用于EV蛋白测定的血液样本，并对这些患者的血浆神经元衍生的EV进行处理，以测定EV中Aβ42、总tau蛋白（t⁃tau）、苏氨酸181磷酸化的tau（P⁃T181⁃tau）、丝氨酸396磷酸化的tau（P⁃S396⁃tau）、神经颗粒蛋白（neurogranin， NRGN）和阻遏物元件1⁃沉默转录因子（repressor element 1 ⁃ silencing transcription， REST）的水平。
根据Winston
对提取的EV进行L1CAM富集。纳米粒子跟踪分析术用于EV的尺寸分布表征分析。使用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（美国Pierce Biotechnology公司）测定EV的蛋白质浓度。
通过人特异性酶联免疫吸附分析（enzyme⁃linked immunosorbent assay， ELISA）法对Aβ42（英国Fujirebio公司）、P⁃T181⁃tau、P⁃S396⁃tau、t⁃tau（美国Life Technologies/Invitrogen公司）、NRGN、REST（美国Research Products⁃Katy公司）进行定量分析。
使用MMSE和阿尔茨海默病评估量表–认知子量表的14项扩展版本（Alzheimer's Disease Assessment Scale⁃cognitive subscale， ADAS⁃cog+）评估AD患者的认知功能。ADAS⁃cog+在检测AD患者认知功能变化方面较ADAS⁃cog具有更高灵敏
采用阿尔茨海默病合作研究–日常生活活动量表（Alzheimer's Disease Cooperative Study⁃Activities of Daily Living， ADCS⁃ADL）对AD患者的日常生活能力进行评估。ADL的得分较高表明AD患者认知功能较好。
AD的严重程度根据基于7项临床访谈的严重程度印象和护理人员输入量表（Clinical Interview Based Impression of Severity， CIBIS）进行分级，CIBIS评分为3～5分（3=轻度AD；4=中度AD；5=重度AD
对照组和AD组患者的平均年龄和性别分布相似。两组患者的MMSE和ADAS⁃cog+评分比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，AD患者的EV中Aβ42、t⁃tau、P⁃T181⁃tau、P⁃S396⁃tau水平显著升高（P<0.05），NRGN水平显著降低（P<0.05）。见
| 项目 | 对照组（n=20） | AD组（n=58） | t/ | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 平均年龄/岁；(x-±s) | 74.42±5.64 | 74.77±7.46 | 0.084 | 0.774 |
| 性别（女）[n(%)] | 15（75.0） | 46（79.3） | 0.280 | 0.603 |
| MMSE评分/分；(x-±s) | 28.10±0.91 | 17.59±4.70 | 85.613 | <0.001 |
| ADAS⁃cog+评分/分；(x-±s) | 17.07±4.71 | 41.10±17.54 | 22.756 | <0.001 |
| Aβ42/(pg/mL) ；(x-±s) | 1.25±0.38 | 1.85±0.50 | 5.582 | 0.020 |
| t⁃tau/(pg/mL) ；(x-±s) | 3.39±0.88 | 4.26±0.98 | 10.937 | <0.001 |
| P⁃T181⁃tau/(pg/mL) ；(x-±s) | 2.28±1.12 | 3.40±0.81 | 27.865 | <0.001 |
| P⁃S396⁃tau/(pg/mL) ；(x-±s) | 2.64±0.15 | 2.93±0.16 | 15.217 | <0.001 |
| NRGN/(pg/mL) ；(x-±s) | 5.52±0.73 | 4.83±0.46 | 11.953 | <0.001 |
| REST/(pg/mL) ；(x-±s) | 6.08±0.58 | 5.69±0.89 | 3.056 | 0.082 |
注： MMSE=简易智力状态检查量表；ADAS⁃cog+=阿尔茨海默病评估量表–认知子量表的14项扩展版本；Aβ=β淀粉样蛋白；t⁃tau=总tau蛋白；NRGN=神经颗粒蛋白；REST=阻遏物元件1⁃沉默转录因子。
与对照组比较，轻中度AD组和重度AD组患者的EV中Aβ42水平增高（P<0.05）。与对照组比较，轻中度AD组和重度AD组患者的EV中t⁃tau水平增高，重度AD组患者高于轻中度AD组患者（P<0.05）。与对照组比较，EV的P⁃T181⁃tau水平轻中度和重度AD患者增高（P<0.05）。轻中度AD组患者的P⁃S396⁃tau的EV水平高于对照组和重度AD组（P<0.05）。与对照组和重度AD组比较，轻中度AD患者的EV中NRGN和REST水平均降低（P<0.05）。见
| 项目 | 对照组（n=20） | 轻中度AD组（n=40） | 重度AD组（n=18） | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aβ42/(pg/mL) ；(x-±s) | 1.25±0.38 |
1.54±0.2 |
1.90±0.6 | 10.380 | 0.001 |
| t⁃tau/(pg/mL) ；(x-±s) | 3.39±0.88 |
3.86±0.4 |
4.43±0.3 | 28.720 | <0.001 |
| P⁃T181⁃tau/(pg/mL) ；(x-±s) | 2.28±1.12 |
2.99±0.8 |
3.59±0.6 | 14.560 | <0.001 |
| P⁃S396⁃tau/(pg/mL) ；(x-±s) | 2.64±0.15 |
2.96±0.1 |
2.75±0.1 | 22.750 | <0.001 |
| NRGN/(pg/mL) ；(x-±s) | 5.52±0.73 |
4.86±0.4 |
5.24±0.5 | 11.300 | <0.001 |
| REST/(pg/mL) ；(x-±s) | 6.08±0.58 |
5.71±0.1 |
5.88±0.1 | 7.755 | 0.001 |
注： *为与对照组相比，P<0.05；#为与轻中度AD组相比，P<0.05。Aβ=β淀粉样蛋白；t⁃tau=总tau蛋白；NRGN=神经颗粒蛋白；REST=阻遏物元件1⁃沉默转录因子。
在AD患者中，EV中t⁃tau、NRGN和REST的水平与MMSE评分和ADCS⁃ADL评分呈负相关（P<0.05），与ADAS⁃cog+评分呈正相关（P<0.05）。见
| 项目 | t⁃tau | NRGN | REST | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| r值 | P值 | r值 | P值 | r值 | P值 | |||
| MMSE评分 | -0.267 | <0.01 | -0.262 | <0.01 | -0.194 | <0.05 | ||
| ADCS⁃ADL评分 | -0.226 | <0.05 | -0.257 | <0.01 | -0.269 | <0.01 | ||
| ADAS⁃cog+评分 | 0.237 | <0.05 | 0.293 | <0.01 | 0.225 | <0.05 | ||
注： MMSE=简易智力状态检查量表；ADCS⁃ADL=阿尔茨海默病合作研究-日常生活活动量表；ADAS⁃cog+=阿尔茨海默病评估量表-认知子量表的14项扩展版本；t⁃tau=总tau蛋白；NRGN=神经颗粒蛋白；REST=阻遏物元件1⁃沉默转录因子。
多奈哌齐组和安慰剂组的临床特征和EV标志物的基线水平相似。治疗24周后与安慰剂组相比，多奈哌齐组诱导EV中的Aβ42、t⁃tau、P⁃T181⁃tau和P⁃S396⁃tau水平显著降低（P<0.05）。治疗24周后与安慰剂组相比，多奈哌齐组的EV中的NRGN和REST水平差异无统计学意义（P>0.05）。见
| 项目 | 安慰剂组（n=19） | 多奈哌齐组（n=18） | t值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| Aβ42 | ||||
| 基线 | 1.87±0.63 | 1.84±0.56 | 0.109 | 0.902 |
| 治疗24周 | 1.74±0.53 | 1.08±0.34 | 2.040 | 0.045 |
| t⁃tau | ||||
| 基线 | 4.21±0.97 | 4.18±1.18 | 0.077 | 0.926 |
| 治疗24周 | 4.41±0.92 | 3.86±1.01 | 2.824 | 0.034 |
| P⁃T181⁃tau | ||||
| 基线 | 3.41±0.97 | 3.60±0.85 | 0.301 | 0.876 |
| 治疗24周 | 3.26±0.82 | 3.23±0.78 | 4.900 | 0.009 |
| P⁃S396⁃tau | ||||
| 基线 | 2.83±0.87 | 2.92±0.86 | 0.444 | 0.643 |
| 治疗24周 | 2.75±0.85 | 2.65±0.86 | 2.770 | 0.037 |
| NRGN | ||||
| 基线 | 5.09±1.05 | 5.20±0.90 | 0.811 | 0.447 |
| 治疗24周 | 5.14±1.13 | 4.97±1.35 | 1.340 | 0.266 |
| REST | ||||
| 基线 | 5.74±0.91 | 5.78±1.06 | 0.376 | 0.833 |
| 治疗24周 | 5.71±0.88 | 5.40±0.91 | 1.497 | 0.207 |
注： t⁃tau=总tau蛋白；NRGN=神经颗粒蛋白；REST=阻遏物元件1⁃沉默转录因子。
有荟萃分析显示，血浆EV中Aβ42、t⁃tau、P⁃T181⁃tau、P⁃S396⁃tau和NRGN水平的测定可作为有效诊断AD的血液生物标志
本研究结果表明，Aβ42和P⁃T181⁃tau的主要变化发生在AD的早期。这一结论得到了以下发现的支持：在AD的临床前和痴呆阶段，这两个指标在EV和CSF中的水平的变化是相似
一项为期20周的临床试验结果显示，在轻度认知障碍受试者中，Aβ42、NRGN和其他突触标记物在血浆EV中的水平不受生长激素的调
目前，多奈哌齐如何影响AD患者血浆EV中Aβ42和tau水平及tau磷酸化的机制尚不清楚。但有研究证实，多奈哌齐治疗可使血清中BDNF水平增加和TNF⁃α水平减
总之，本研究发现，轻重度AD患者血浆EV中Aβ42、t⁃tau、P⁃T181⁃tau和P⁃S393⁃tau水平升高，而EV中t⁃tau、NRGN和REST水平的增加与认知功能和生活能力的下降相关。此外，多奈哌齐治疗使轻中度AD患者的血浆EV中t⁃tau、P⁃T181⁃tau和P⁃S396⁃tau水平降低。因此，采用神经元衍生的细胞EV可作为监测多奈哌齐治疗AD疗效的有效工具。
由于本研究纳入的样本量较少，本研究的结论需要在未来更大样本量的前瞻性研究中进行验证。
参 考 文 献
刘志安，林燕玲，韩爱东．Aβ寡聚体与阿尔茨海默病[J]．中山大学学报（自然科学版）, 2022, 61(3): 1⁃10. [百度学术]
唐雄林，唐海丹，蒋柳艳，等．吡拉西坦联合盐酸多奈哌齐对阿尔茨海默病大鼠海马区小胶质细胞活化的影响[J]．中国临床药理学杂志, 2022, 38(4): 328⁃332. [百度学术]
HORSAGER J, ANDERSEN KB, KNUDSEN K, et al. Brain⁃first versus body⁃first Parkinson's disease: a multimodal imaging case⁃control study[J]. Brain, 2020, 143(10): 3077⁃3088. [百度学术]
PISANI S, MUELLER C, HUNTLEY J, et al. A meta⁃analysis of randomised controlled trials of physical activity in people with Alzheimer's disease and mild cognitive impairment with a comparison to donepezil[J]. Int J Geriatr Psychiatry, 2021, 36(10): 1471⁃1487. [百度学术]
CHOI HJ, PARK JH, JEONG YJ, et al. Donepezil ameliorates Aβ pathology but not tau pathology in 5xFAD mice[J]. Mol Brain, 2022, 15(1): 63. [百度学术]
KIM KY, SHIN KY, CHANG KA. Brain⁃derived exosomal proteins as effective biomarkers for Alzheimer's disease: a systematic review and meta⁃analysis[J]. Biomolecules, 2021, 11(7): 980. [百度学术]
DELGADO⁃PERAZA F, NOGUERAS⁃ORTIZ CJ, VOLPERT O, et al. Neuronal and astrocytic extracellular vesicle biomarkers in blood reflect brain pathology in mouse models of Alzheimer's disease[J]. Cells, 2021, 10(5): 993. [百度学术]
MA F. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders⁃5 (DSM⁃5)[M]//Gu DN, Dupre ME. Encyclopedia of Gerontology and Population Aging. Cham: Springer International Publishing, 2021: 1414⁃1425. [百度学术]
WINSTON CN, ROMERO HK, ELLISMAN M, et al. Assessing neuronal and astrocyte derived exosomes from individuals with mild traumatic brain injury for markers of neurodegeneration and cytotoxic activity[J]. Front Neurosci, 2019, 13: 1005. [百度学术]
HAMMERS DB, KOSTADINOVA RV, SPENCER RJ, et al. Sensitivity of memory subtests and learning slopes from the ADAS⁃cog to distinguish along the continuum of the NIA⁃AA research framework for Alzheimer's disease[J]. Neuropsychol Dev Cogn B Aging Neuropsychol Cogn, 2023, 30(6): 866⁃884. [百度学术]
Samara M, Levine SZ, Yoshida K, et al. Linking the clinical dementia rating scale⁃sum of boxes, the clinician's interview⁃based impression plus caregiver input, and the clinical global impression scale: evidence based on individual participant data from five randomized clinical trials of donepezil[J]. J Alzheimers Dis, 2021, 82(3): 1075⁃1084. [百度学术]
WINSTON CN, GOETZL EJ, SCHWARTZ JB, et al. Complement protein levels in plasma astrocyte⁃derived exosomes are abnormal in conversion from mild cognitive impairment to Alzheimer's disease dementia[J]. Alzheimers Dement (Amst), 2019, 11: 61⁃66. [百度学术]
ZHAO AN, LI YY, YAN Y, et al. Increased prediction value of biomarker combinations for the conversion of mild cognitive impairment to Alzheimer’s dementia[J]. Transl Neurodegener, 2020, 9(1): 30. [百度学术]
JIA LF, ZHU M, KONG CJ, et al. Blood neuro⁃exosomal synaptic proteins predict Alzheimer's disease at the asymptomatic stage[J]. Alzheimers Dement, 2021, 17(1): 49⁃60. [百度学术]
MORI Y, TSUJI M, OGUCHI T, et al. Serum BDNF as a potential biomarker of Alzheimer's disease: verification through assessment of serum, cerebrospinal fluid, and medial temporal lobe atrophy[J]. Front Neurol, 2021, 12: 653267. [百度学术]
ARIOZ BI, TUFEKCI KU, OLCUM M, et al. Proteome profiling of neuron⁃derived exosomes in Alzheimer's disease reveals hemoglobin as a potential biomarker[J]. Neurosci Lett, 2021, 755: 135914. [百度学术]
VANDENDRIESSCHE C, KAPOGIANNIS D, VANDENBROUCKE RE. Biomarker and therapeutic potential of peripheral extracellular vesicles in Alzheimer's disease[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2022, 190: 114486. [百度学术]
GHOLAMI J, NEGAH SS, RAJABIAN A, et al. The effect of combination pretreatment of donepezil and environmental enrichment on memory deficits in amyloid⁃beta⁃induced Alzheimer⁃like rat model[J]. Biochem Biophys Rep, 2022, 32: 101392. [百度学术]
SHPAK A, GUEKHT A, DRUZHKOVA T, et al. Increased ciliary neurotrophic factor in blood serum and lacrimal fluid as a potential biomarkers of focal epilepsy[J]. Neurol Sci, 2022, 43(1): 493⁃498. [百度学术]
